Blog O Kluczowe zasady i rozwiązywanie problemów z zestawami do ekstrakcji kwasów nukleinowych

Ekstrakcja kwasu nukleinowego służy jako kamień węgielny eksperymentów biologii molekularnej./wielu badaczy jest zdezorientowanych, zwłaszcza w przypadku rozwiązywania problemów z nieoczekiwanymi wynikami. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, wydajny proces.

Większość komercyjnych zestawów ekstrakcji kwasów nukleinowych wykorzystuje technologię kolumny spin membrany krzemianowej, z pięcioma krytycznymi etapami: liza komórkowa, wiązanie kwasów nukleinowych, mycie i oczyszczanie, suszenie,i końcowa elucjaKażdy krok opiera się na poprzednim, co oznacza, że każdy błąd może zagrozić całej ekstrakcji.

Efektywna liza komórkowa jest kluczowym pierwszym krokiem.ale zazwyczaj zawierają wysokie stężenia soli chaotropowych, które służą podwójnemu celowi:

• Denaturacja białka:Soły te zakłócają wiązania wodorowe, siły van der Waals i interakcje hydrofobowe, destabilizując białka (w tym nukleasy), aby zapobiec degradacji kwasów nukleinowych.
• Ułatwiające wiązanie krzemionki:Chaotropy przemieszczają cząsteczki wody z kwasów nukleinowych, tworząc optymalne warunki do transferu na błony krzemianowe.

Do najczęściej stosowanych soli chaotropowych należą hydrochlorek guanidiny, tiocyanat guanidiny, mocznik i perchloran litu.W zależności od rodzaju próbkiProteinasa K skutecznie trawi białka w preparatach kwasów nukleinowych, zwłaszcza w warunkach denaturacji.chociaż jego aktywność zmniejsza się w warunkach denaturacji.

Ekstrakcja plazmidów różni się znacząco od izolacji RNA lub genomowego DNA.Dodawanie soli chaotropowych natychmiast uwolni wszystkie typy DNA bez rozróżnieniaDlatego protokoły plazmidowe zazwyczaj wprowadzają chaotropy po początkowej lizie komórkowej.

Oprócz lizy soli chaotropowe ułatwiają wiązanie kwasu nukleinowego z kolumnami krzemianowymi.Kolumny krzemianowe zawierają żywicę, która selektywnie wiąże się z DNA lub RNA w zależności od stężenia soli i innych czynnikówPowstałe kwasy nukleinowe wykazują wysoką czystość, nadają się do klonowania, długotrwałego sekwencjonowania i innych zastosowań.

Nadmiar etanolu powoduje osadzanie się rozkładu i małych cząsteczek, wpływając na odczyty absorpcji A260.Niewystarczająca ilość etanolu może utrudniać usuwanie soli z membranPodawane w zestawie ilości etanolu są wstępnie zoptymalizowane, ale jeśli degradowane DNA wydaje się zakłócać odczyty A260, ponowna optymalizacja stężenia etanolu może pomóc.Roztwory przepływowe mogą być zapisywane do osadzenia w celu odzyskania utraconych kwasów nukleinowychW przypadku stosowania detergentów zawierających SDS w lizy, NaCl służy jako skuteczny precipitant, który zapobiega zanieczyszczeniu detergentem.

Po odśrodkowaniu lizytu przez błony krzemianowe, docelowe kwasy nukleinowe wiążą się z kolumnami, podczas gdy białka i polisacharydy pozostają w przepływie.membrany zachowują pozostałe białka i solePróbki roślin mogą pozostawiać polisacharydy i pigmenty; próbki krwi często wywołują brązowe lub żółte przebarwienie.

Zazwyczaj występują dwa prania, chociaż dokładna liczba zależy od rodzaju próbki.następnie mycie etanolowe w celu usunięcia soliPróbki początkowo niskiej zawartości białek (np. preparaty plazmidowe lub oczyszczanie produktu PCR) mogą wymagać tylko prania etanolowego.Niektóre zestawy zalecają podwójne mycie etanoluPozostałe sole hamują elucję, zmniejszając wydajność i zwiększając odczyty A230, co obniża stosunki A260/230.

Większość protokołów obejmuje odśrodkowanie po myciu, aby wysuszyć pozostały etanol z kolumn.Dodawanie 10 mM buforu Tris lub wody, następnie rehydratacja kwasów nukleinowych w celu uwolnienia błonyPozostały etanol zapobiega całkowitemu rehydratacji i elucji.oznaki wskazujące obejmują próbki, które nie osadzają się w studniach żelu agarosowego (nawet przy obecności barwnika do ładowania) lub niezdolność do zamarzania w temperaturze -20 °C.

W ostatnim etapie ekstrakcji DNA uwalnia się czyste kwasy nukleinowe z krzemianu.DNA pozostaje bardziej stabilne w słabo alkalicznym pH i szybciej rozpuszcza się w buforze niż w wodzieWoda zazwyczaj wykazuje niższy pH (4-5), a DNA o wysokiej masie cząsteczkowej może nie być całkowicie odwodnione szybko.przed odśrodkowaniem pozostawić bufor na błonach przez kilka minutW przypadku zastosowań wymagających nienaruszonego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (np. sekwencjonowania długiego odczytu) optymalne są bufory elucyjne. RNA toleruje słabo kwaśne pH i łatwo rozpuszcza się w wodzie,Woda jest preferowanym rozcieńczalnikiem.

Nawet po zastosowaniu standardowych protokołów, ekstrakcje mogą mieć różne problemy:

• Niska wydajność:Często wynika to z niepełnej lizy lub nieoptymalnych warunków wiązania.Niskiej jakości lub stary etanol może wchłaniać wilgoćPamiętaj, że niewłaściwie przygotowane bufory do prania mogą odbierać wydobyte kwasy nukleinowe!
• Niska czystość:Zanieczyszczenie białka często wynika z nadmiaru materiału wyjściowego zwiększającego ryzyko niekompletnego rozpuszczenia.Użyj etanolu najwyższej jakości do buforów do prania, a jeśli problemy utrzymują się, dodaj dodatkowe kroki mycia.
• Zanieczyszczenia:Próbki środowiskowe okazują się szczególnie wrażliwe na substancje huminowe, które współoczyszczają się z DNA i są odporne na usunięcie kolumny krzemianowej.Specjalistyczne techniki mogą usunąć ingerujące białka i humiki przed wiązaniem kolumny.
• Rozkład:RNA ma większe ryzyko degradacji, zazwyczaj z powodu niewłaściwego przechowywania próbki lub nieefektywnej lizy (założywszy, że użyto wody wolnej od RNasy).degradacja ma mniejsze znaczenie dla zastosowań PCR, ale staje się kluczowa dla długotrwałego sekwencjonowania, wymagającego nienaruszonego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej!
• Oczyszczanie produktu PCR:Chociaż nie jest to ściśle ekstrakcja DNA, warto wspomnieć, że zwykle przed oczyszczeniem kolumny spin dodaje się 3-5 tomów roztworu soli na objętość reakcji PCR.Nieudane oczyszczenia zwykle wynikają z nieudanej PCR, ale oszczędzanie przepływu jest mądre jeśli przejrzyste pasma PCR nie wiążą kolumn, prawdopodobnie pozostaną w przepływie do odzyskania i ponownego oczyszczania.

Niepełna liza może przejawiać się w nieoczekiwanie niskich plonach, niepełnym rozpuszczeniu białka lub słabym stosunku A260/230.Wyniki te sugerują, że niektóre składniki próbki nie ulegały całkowitemu lizowaniu lub rozpuszczeniu podczas ekstrakcji.Rozróżnienie niepełnej lizy od zanieczyszczenia lub degradacji wymaga dokładnej analizy warunków ekstrakcji, w tym składu buforu lizy, parametrów inkubacji,i potencjalnych substancji zakłócającychPrzykładowo, złe stosunki A260/230 mogą wskazywać na pozostałości soli po wiązaniu lub na niewystarczające mycie, a nie na niepełną lizę.Zastosowanie niepełnej lizy może wymagać optymalizacji komponentów buforu lizy, czasy inkubacji lub wykorzystanie dodatkowych metod lizy mechanicznej/enzymatycznej.

Specjalistyczne techniki mają na celu usuwanie substancji huminowych i innych interferentów, które mogą współoczyszczać z kwasami nukleinowymi z próbek środowiskowych.Należą do nich specjalistyczne bufory ekstrakcyjne zawierające czynniki chelatyzujące (np..g., EDTA) do selektywnego wiązania i usuwania kationów.Metody wstępnej obróbki, takie jak odśrodkowanie różnicowe lub filtracja, mogą pomóc w usunięciu większych cząstek stałych z próbek środowiskowych przed ekstrakcją kwasu nukleinowego, zmniejszając zakłócenia podczas etapów wiązania.

Niektóre próbki (np. tkanki lub materiały bogate w lipidy) stwarzają szczególne wyzwania.Próbki tkanek często wymagają dodatkowego zakłócenia mechanicznego lub enzymatycznego trawienia w celu zapewnienia pełnej lizy i uwalniania kwasu nukleinowegoWzorce bogate w lipidy mogą komplikować oczyszczanie, ponieważ lipidy mogą zakłócać wiązanie kwasu nukleinowego z matrycami kolumn.optymalizacja protokołów oczyszczania, lub przy użyciu specjalnie zaprojektowanych zestawów.

Pierwotnie opublikowane 28 czerwca 2010 r. Przeglądane i ponownie opublikowane w maju 2021 i marcu 2024 r.