Jeśli konwencjonalna PCR służy jako "skło powiększające" biologii molekularnej, to ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) funkcjonuje jako precyzyjny "mikroskop".Ta zaawansowana technologia nie tylko wzmacnia sekwencje genów, ale także śledzi proces wzmacniania w czasie rzeczywistym., umożliwiające precyzyjne określenie ilościowe poziomu ekspresji genów.Przejście od szacunków przybliżonych PCR punktu końcowego do dokładności i wydajności PCR w czasie rzeczywistym stanowi nieuniknioną ewolucję w nowoczesnych badaniach biologii molekularnej.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), rewolucyjna technika w biologii molekularnej, wykorzystuje sekwencyjnie specyficzne oligonukleotydy, polimerazę DNA odporną na ciepło,i precyzyjne cykle termiczne do wykładniczej replikacji określonych sekwencji DNA lub cDNA, osiągając milion razy wzmocnienie. Traditional endpoint PCR requires post-reaction detection and quantification through gel electrophoresis and image analysis—a time-consuming process with limited precision that struggles to meet growing demands for quantitative analysis.
QPCR w czasie rzeczywistym przekształcił ten krajobraz przez monitorowanie wytwarzania produktów podczas każdego cyklu PCR.Naukowcy mogą określić początkowe ilości sekwencji docelowej z wyjątkową dokładnościąPodczas gdy PCR teoretycznie podwaja cząsteczki docelowe w każdym cyklu, wczesne próby ilościowego określenia materiału wyjściowego poprzez liczbę cykli i pomiary produktu końcowego okazały się niewiarygodne.QPCR w czasie rzeczywistym pojawiło się w celu zaspokojenia dużych potrzeb ilościowych, podczas gdy PCR końcowa pozostaje przede wszystkim przydatna do wzmacniania konkretnych fragmentów DNA do sekwencjonowania, klonowania i innych zastosowań biologii molekularnej.
Technologia ta mierzy zawartość DNA po każdym cyklu za pomocą barwników fluorescencyjnych wiążących się z produktami PCR (amplikony).umożliwiające ilościowe określenie kwot początkowych wzorców poprzez monitorowanie zmian sygnałówDo najczęściej używanych rejestratorów fluorescencyjnych należą:
Specjalistyczne instrumenty łączą cykle termiczne ze skanowaniem fluorescencyjnym w celu generowania krzywych wzmacniania (rysunek 1), które wykresują intensywność fluorescencji w stosunku do liczb cykli,reprezentujące akumulację produktu w trakcie procesu PCR.
Technologia ta stała się złotym standardem wykrywania i ilościowania DNA/RNA, osiągając dwukrotną dokładność z zakresami dynamicznymi obejmującymi 6-8 porządków wielkości.
Standardowy protokół PCR w czasie rzeczywistym przeprowadza 40 cykli, z których każdy obejmuje:
Inkubacja w wysokiej temperaturze (zwykle 95 ° C) stopi DNA z podwójnymi niciami w pojedyncze nici, zakłócając struktury wtórne.
Sekwencje uzupełniające hybrydują się w temperaturach 5°C poniżej temperatury topnienia primerów (Tm).
Polimeraza DNA działa optymalnie w temperaturze 70-72°C, rozszerzając primery z prędkością do 100 baz/sekundę.
To podejście przede wszystkim odwraca transkrypcję RNA do cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy (RT) z losowymi, oligo ((dT) lub specyficznymi dla genu primerami.Około 10% cDNA jest następnie przenoszone do oddzielnych rur do PCR w czasie rzeczywistym.Zalety obejmują:
Połączenie syntezy cDNA i PCR w jednej rurce zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i błędy w obsłudze.co sprawia, że jest idealny do zastosowań o wysokiej przepustowości.
PCR w czasie rzeczywistym pełni kluczowe funkcje w zakresie:
Wschodzące technologie, takie jak cyfrowa PCR i analiza topnienia o wysokiej rozdzielczości, obiecują rozszerzyć aplikacje PCR w czasie rzeczywistym.i zdolności analizy danychW przyszłości zastosowania mogą obejmować medycynę spersonalizowaną, monitorowanie środowiska,W celu zwiększenia bezpieczeństwa żywności i testowania bezpieczeństwa żywności zastosowanie PCR w czasie rzeczywistym jako niezbędnego narzędzia rozwoju naukowego i zdrowia publicznego.
Osoba kontaktowa: Ms. Lisa
Polish
