Interpretacja zasad testowania RTPCR i ryzyko COVID-19

W miarę jak pandemia COVID-19 nadal stwarza globalne wyzwania, testy RT-PCR (Reakcja Łańcuchowa Polimerazy z Odwrotną Transkrypcją) pozostają złotym standardem w diagnozowaniu infekcji SARS-CoV-2. Ale ilu naprawdę rozumie zasady naukowe stojące za tym kluczowym narzędziem diagnostycznym? Ten artykuł dostarcza dogłębnego, a zarazem przystępnego wyjaśnienia testów RT-PCR, pomagając zarówno pracownikom służby zdrowia, jak i ogółowi społeczeństwa lepiej zrozumieć tę istotną technologię.

RT-PCR, czyli Reakcja Łańcuchowa Polimerazy z Odwrotną Transkrypcją w Czasie Rzeczywistym, to wysoce czuła i szybka technika biologii molekularnej stosowana do wykrywania specyficznego materiału genetycznego w próbkach. Ten materiał genetyczny może pochodzić od ludzi, bakterii lub wirusów, takich jak SARS-CoV-2.

Podstawową technologią stojącą za RT-PCR jest PCR, wynaleziona przez Kary'ego B. Mullisa w latach 80. XX wieku (co przyniosło mu Nagrodę Nobla). PCR wzmacnia i wykrywa specyficzne cele DNA. Późniejsze ulepszenia umożliwiły „w czasie rzeczywistym” wizualizację i kwantyfikację celów DNA podczas amplifikacji. W PCR w czasie rzeczywistym intensywność fluorescencji ze specjalistycznych sond koreluje z ilością amplifikowanego DNA.

Jednak standardowy PCR wykrywa tylko DNA. Ponieważ SARS-CoV-2 zawiera materiał genetyczny RNA, test wymaga enzymu odwrotnej transkryptazy do konwersji RNA na komplementarny DNA (cDNA). Ten etap odwrotnej transkrypcji, połączony z PCR w czasie rzeczywistym, sprawia, że RT-PCR jest potężnym narzędziem do wykrywania wirusów RNA, takich jak SARS-CoV-2.

Zrozumienie RT-PCR wymaga podstawowej wiedzy o materiale genetycznym – instrukcji obsługi, która reguluje zachowanie komórkowe i wirusowe, przetrwanie i reprodukcję. Materiał genetyczny występuje w dwóch podstawowych formach: DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) i RNA (kwas rybonukleinowy). DNA charakteryzuje się strukturą dwuniciową, podczas gdy RNA jest jednoniciowy. Do celów diagnostycznych większa stabilność DNA sprawia, że jest on preferowany do testowania chorób zakaźnych. Warto zauważyć, że SARS-CoV-2 zawiera tylko RNA.

Wszystkie wirusy dzielą cechę polegającą na zależności od komórek gospodarza dla przetrwania i replikacji. SARS-CoV-2, podobnie jak inne wirusy, atakuje zdrowe komórki w celu reprodukcji. Kiedy dochodzi do infekcji, wirus uwalnia swoje RNA i przejmuje kontrolę nad maszynerią komórkową w celu replikacji. Dopóki materiał genetyczny wirusa pozostaje w komórkach, RT-PCR może wykryć infekcję SARS-CoV-2.

Przeszkoleni pracownicy służby zdrowia pobierają próbki z wymazu z nosogardzieli, które następnie umieszcza się w sterylnych probówkach zawierających medium transportowe do zachowania integralności wirusa.

W laboratorium naukowcy ekstrahują RNA za pomocą komercyjnych zestawów oczyszczających. Próbka RNA jest następnie dodawana do mieszaniny reakcyjnej zawierającej wszystkie niezbędne składniki do testowania, w tym polimerazę DNA, odwrotną transkryptazę, bloki budulcowe DNA oraz specyficzne dla SARS-CoV-2 sondy fluorescencyjne i startery.

Ponieważ PCR działa tylko z matrycami DNA, odwrotna transkryptaza konwertuje całe RNA w próbce (w tym ludzkie, bakteryjne, inne RNA koronawirusów i potencjalnie RNA SARS-CoV-2) na cDNA.

Proces ten obejmuje trzy powtarzające się etapy:

• Denaturacja: Ogrzewanie DNA do >90°C przez około 10 minut rozdziela dwuniciowe DNA na pojedyncze nici.
• Przyłączanie starterów: Specjalnie zaprojektowane krótkie fragmenty DNA (startery) przyłączają się do specyficznych celów cDNA SARS-CoV-2 w niższych temperaturach. Typowe cele genowe COVID-19 obejmują polimerazę RNA zależną od RNA (RdRP), ORF1ab, gen S (białko kolca), gen N (nukleokapsyd) i gen E (osłonka).
• Elongacja: Polimeraza DNA wykorzystuje startery jako punkty wyjścia do tworzenia identycznych kopii docelowych segmentów DNA.

Proces powtarza się zazwyczaj 40 razy, podwajając docelowe DNA z każdym cyklem. Sondy fluorescencyjne wiążą się poniżej starterów, uwalniając wykrywalne sygnały z każdą amplifikacją DNA. Zwiększająca się ilość docelowego DNA koreluje ze wzrostem intensywności fluorescencji.

Dane fluorescencyjne generują „Próg Cyklu” (Ct) – liczbę cykli potrzebnych do przekroczenia poziomu tła przez sygnał. Próbki z większą ilością docelowego DNA amplifikują się szybciej, wymagając mniejszej liczby cykli (niższe wartości Ct). I odwrotnie, niewielka ilość docelowego DNA wymaga więcej cykli (wyższe wartości Ct).

Wartości Ct dostarczają kluczowych informacji o obciążeniu wirusem. Niższe wartości Ct wskazują na większą ilość genomu wirusa, podczas gdy wyższe wartości sugerują mniejsze ilości. Pracownicy służby zdrowia łączą wartości Ct z objawami klinicznymi i historią, aby ocenić stadium choroby. Seryjne wartości Ct z powtarzanych testów pomagają monitorować postęp choroby i przewidywać powrót do zdrowia. Osoby śledzące kontakty również wykorzystują wartości Ct do priorytetowego traktowania pacjentów z najwyższym obciążeniem wirusem (a tym samym największym ryzykiem przenoszenia).

• Obciążenie wirusem: Wartości Ct są odwrotnie skorelowane z obciążeniem wirusem – niższe Ct oznacza obecność większej ilości wirusa.
• Stadium choroby: Wczesna infekcja zwykle wykazuje wysokie obciążenie wirusem (niskie Ct), podczas gdy późniejsze stadia wykazują spadek obciążenia (wzrost Ct) w miarę jak układ odpornościowy oczyszcza infekcję.
• Ryzyko przenoszenia: Wyższe obciążenie wirusem (niższe wartości Ct) wskazuje na większy potencjał przenoszenia, uzasadniając bardziej rygorystyczne środki izolacji.

Pomimo tego, że jest złotym standardem diagnostycznym COVID-19, RT-PCR ma ograniczenia:

• Fałszywe wyniki negatywne: Niewłaściwe pobieranie próbek, niskie obciążenie wirusem lub wczesne testowanie mogą dawać wyniki negatywne pomimo rzeczywistej infekcji.
• Fałszywe wyniki pozytywne: Rzadkie, ale możliwe wyniki pozytywne bez rzeczywistej infekcji.
• Wyzwania związane ze standaryzacją: Różne laboratoria i platformy mogą używać różnych progów Ct, co komplikuje porównania.

Testy RT-PCR pozostają niezbędne do diagnozy COVID-19 poprzez wykrywanie materiału genetycznego SARS-CoV-2. Wartości Ct służą jako istotne wskaźniki obciążenia wirusem, przebiegu choroby i ryzyka przenoszenia. Jednak ograniczenia testów wymagają łączenia wyników z oceną kliniczną w celu dokładnej diagnozy i leczenia.